Új lehetôség Fitopatogén baktériumok okozta veszteségek megelôzésére

 

Detre Tamás1, Komáromi István1, Oros Gyula2, Rejtô Lajos1 és Szegô András1

 

1Vet-Pharma Kft., 1225 Budapest - Nagytétény Bányalég u. 2.

2MTA Növényvédelmi Kutatóintézete, 1525 Budapest 114. Pf. 102.

 

A korábban elsôsorban állatgyógyászatban használatos furazolidon jelen­tôs mértékben és szelek­tív módon gátolja a fitopatogén Erwi­nia és Xanthomonas fajo­kat (MIC < 25 mg/L). Különös elônye, hogy hatékony a streptomycin-ellenálló törzsek ellen is. Benzi­mi­dazol származékokkal szi­nergeti­kus módon hat több növé­nyi kórokozóra, azaz gom­bák (Cytospora, Fusarium, Helminthosporium) és bakté­ri­umok (Erwinia, Xanthomo­nas) esetében egyaránt hatás­növekedés áll elô, a fitotoxicitás csökkenése mellett. Modell­kísérletekben kimutattuk, hogy az ilyen keverékekkel szemben a rezisztencia kelet­kezésének gyakorisága (f) nagyon alacsony (f < 10-9), így ezen készítmények várható piaci élettartama jelentôsen meghaladhatja az anti­bio­tiku­mokét (f=10-5-10-6). Az optimizált keverék hatékony­sága eléri a benomilét, illetve a sztreptomicinét.

 

Bevezetés

 

Az ember, az állatok és a növények egészégét veszélyeztetô tényezôk között nagy jelen­tôségû, a különbözô rendszertani helyzetû baktériumok által okozott megbetegedések leküzdésében áttörést jelentett az antibiotikumok felfedezése és felhasználása. Azonban a szerzett antibiotikum rezisztencia megjelenése a kórokozó baktériumok populációiban eleinte lokálisan, azonban ma már világszerte növekvô gondot okoz, és számos, koráb­ban nagyhatású antibiotikum gyakorlatból történô kiszorulásához vezetett. A megvé­den­dô szervezetek között a növények sajátos helyet foglalnak el, részben a hely­hez kö­tött életmód és a talaj, mint élô közeg miatt. Az iparszerû termesztési módok általánossá válása elôtt a széles hatásspektrumú csávázószerek (higany, réz, fémorga­ni­kus komple­xek) a maggal terjedô baktériumokat eliminálták, és a hagyo­má­nyos vetés­for­gók alkal­ma­zása biztosította a talajok kórokozó mentesítését. Az antibiotikumokhoz hasonlóan a növényvédôszerek újabb nemzedékei elôdeiknél lé­nye­gesen szû­kebb hatás­spekt­rummal rendelkeznek (Lyr, 1987), illetve ugyancsak az antibiotikumokhoz hason­lóan velük szemben is gyorsan elle­nállóság ala­­kul ki a célbavett kórokozók popu­lá­cióiban (Dekker, 1987), ami esetenként egy adott készítmény teljes hatás­vesz­té­sé­hez vezet (1. táblázat).

 

1. táblázat   Hatékonyság változás a szerzett ellenállóság következtében.

 

Növény: alma

Minimális gátló koncentrációk (MIC mg/L)

 

Kórokozó

Betegség

KF 73 40 fwc

Sztreptomycin

Benomyl

Erwinia amylovora

hajtásszáradás

2

2

>100

     E. amylovora (ATCC 15580-bôl)a

2

>100

>100

Botrytis cinerea - Wb

gyümölcs

1

>100

0.5

 

B. cinerea - R

rothadás

5

>100

>100

Venturia inaequalis - W      varasodás

0.2

>100

1

 

V. inaequalis - R

 

1

>100

>100

 

a= laboratóriumi spontán mutáns, b=W - benomil érzékeny, R - benomil ellenálló, c= KF 73 40 fw, furazolidon és karbendazim hatóanyagokat 3+7 arányban tartalmazó készítmény.

A növénykórokozó baktériumok terjedésének fentiek mellett a hagyományos vetésforgó elhagyása, a magashozamú fajták be­vezetése és a mono­polizált vetômagforgalmazás, a karantén szabályok semmi­be­vétele ugyancsak ked­vez. A gomba- és a vírusok okozta növény­betegségek számosságukat tekintve megelôzik baktériumok által kiváltottakat (2. táblázat), és utóbbiak nem is okoznak olyan méretû veszteségeket, mint például  a liszt­harmatok, rozsdák vagy peronoszpórák. Néhány esetben azonban (alma és citrus félék, rizs, tárolt burgonya) a baktériumfertôzések (Erwinia, Xanthomonas) katasztrófális veszteségeket okozhatnak.

 

2. táblázat  Fôbb termeszetett növények betegségei kórokozó csoportok szerint.a

 

Növény         

Gomba      

Vírus          

Baktérium              

Búza         

  43            

  31                

    5

Rizs             

  35           

  16                

    8

Kukorica            

  65           

  13                

    8

Burgonya          

  37           

  24                

    6

Szója      

  40           

  18                

    7

Alma

  71           

  12                

    6

 

a= APS Disease Compendium szerint számolva.

 

A növénykórokozó baktériumok elleni védekezés nem megoldott. Sajnos egyértel­mûen be­bizonyosodott, hogy az antibiotikumok agronómiai célú felhasz­ná­lása során a rezisz­tencia gyorsan kialakul (Manulis és tsai, 1998; Knudsen, 2001; Sholberg és tsai, 2001), illetve az eközben keletkezett rezisztens törzsek az em­ber­re nézve is különösen veszé­lyesek (Palmer és tsai, 1997; Smalla és tsai, 2001), a növényi bakteriózisok leküz­désére más, új hatásmódú vegyü­leteket kell keresni.

Random screening során derítettük ki, hogy az aromás gyûrûn nitro-csoportot hordozó vegyületek között  kiváló baktericid hatásúak is elôfordulnak.  Jelen közleményünkben a furazolidon (1. ábra) agrotechnikai felhasználhatóságáról számolunk be.

 

Anyag és módszerek

 

A felhasznált hatóanyagok és egyéb vegyületek kereskedelmi forgalomból származnak.

A furazolidon gyógyszerkönyvi minõségû volt. A karbendazimot a technikai ható­anyag­ból két­szeri átkristályosítással nyertük ki.  A KF-73 40 fw a Vet-Pharma készítménye.

 

Furazolidon

Karbendazim

 

1.ábra A szinergetikusan együttható vegyületek szerkezete.

 

Más közleményeinkben (Oros, Szôgyi és Cserháti, 1986; Matol­csy és tsai. 1994; Oros, Ujváry és Nachman, 1999; Oros és Ujváry 1999; Oros,  Cserháti és Forgacs , 2001) részletesen ismertettük az alkalmazott mód­szere­ket (táptalajok, felhasználási módok és ered­mények értékelése, stb), illetve a vizs­gált törzseket. Az esetleges eltéréseket az adat­táblázatoknál közüljük.

 

Eredmények és megvitatásuk

 

Az elôzetes szûrôvizsgálatok során többszáz vegyület 25 baktérium és 45 mikrogomba fajra gyakorolt hatását tanulmányoztuk. Az eredmények ismertetése meghaladja e dol­go­zat kereteit. A vegyületek közül hatékonyságukkal és széles hatásspektrumukkal ki­tûn­tek a nitro-csoportot tartalmazó különbözô származékok. Sajnos, többségük terape­u­ti­kus értékét illetve felhasználhatóságát fitotoxikus hatásuk, vagy gyors lebomlásuk csök­kenti, továbbá hatásspekt­rumuk túlságosan széles, és erôsen toxikus me­ta­bolitok keletkezése sem zárható ki a molekulák lebomlási módjainak ismeretében. Tekintettel arra, hogy a természetben, így a növényvédelmi célú alkalmazás területén is elôforduló mikro­organizmusok többsége hasznos szervezet, és csak csekély részük okoz termés­ki­eséshez vezetô megbetegedéseket, a gátlóhatás szelektivitásának magas foka alapvetô kö­vetelmény. Továbbá a megvédendô növény, illetve kórokozója között is jelentôs érzé­keny­ségbeli különbségnek kell fennállnia elôbbi javára (terapeutikus index<5). A fenti meg­fonto­lá­sok figyelembevéte­lé­vel szûrtük ki a korábban elsôsorban állat­gyógyá­szat­ban használatos nitrofurán szár­ma­zékokat (ND),  melyek szelektív mó­don és jelentôs mértékben gátolták a fitopatogén Erwi­nia és Xanthomonas fajokat (MIC < 25 mg/L).  Az alkil-nitro származékok (bronopol, fenitropan) hatásspektruma elôbbiekhez képest szélesebb, vagy jelentéktelen baktericid hatásuk van (nitrothal-i-propil). Az aromás nitro-vegyületek között jelentôs mikrobicid hatással rendelkezôk vannak, azonban terape­uti­kus értékük alacsony a gazdanövények érzékenysége miatt (Dinoseb). A dinocap in vit­ro ugyancsak hatékony volt, azonban hatása in vivo elmaradt a várttól, vélhetôen gyors meta­bolizálódása miatt. Egy agrobaktericid esetében kívánatos, ha mennyisége a kijut­ta­tás helyén legalább 10 napon keresztül nem csökken a terapeutikus szint alá. Fenti feltételeknek a vizsgált 17 nitro-származék közül csak a furazolidon  és a nitrofurantoin felel meg. További elônyként jelentkezik, hogy a ND-származékok és a baktérium sejt­hártyák proton-pum­páját szelektíven bénító benzimidazol-származékok (Sachs, 1997) szi­nergeti­kus módon hatnak több növényi kórokozóra (3. táblázat).

 

3. táblázat A karbendazim hatása a furazolidon antibakteriális hatásspektrumára.

 

 

Minimális gátló koncentráció (mg/L)

Baktériumok

Sztrepomicin

KF73

Furazolidon

HgCl2

    Patogén

 

 

 

 

Agrobacterium tumefaciens

2-4

1-2

2-4

1-2

Erwinia amylovora

1-2

0.5-1

4-8

4-8

E. carotovora

2-4

0.13-0.25

1-2

1-2

Xanthomonas malvacearum

1-2

1-2

4-8

0.5-1

Corynebacterium michiganense

0.5-1

0.13-0.25

0.5-1

0.5-1

    Szaprofiton

 

 

 

 

Erwinia herbicola

2-4

>100

>100

1-2

Pseudomonas fluorescens

4-8

>100

>100

2-4

    Szimbiont

 

 

 

 

Rhizobium trifolii

0.5-1

>100

>100

2-4

 

A karbendazim 500 mg/L koncentrációban sem gátolta a vizsgált fajokat.

 

Az optimizált keverék hatékony­sága eléri a sztreptomicinét és a higanykloridét. Elônye azonban, hogy nem gátolja a  fitoszférában jelentôs antagonista szerepet játszó E. herbi­cola és P. fluorescens szapro­fiton baktériumokat (Nuclo és tsai, 1998), illetve a szim­biont nitrogénkötô Rhizobiumot. Különös elônyként jelent­kezik, hogy a furazolidon tar­tal­mú készítmények streptomycin-ellenálló törzsek ellen is jól hatottak (1. táblázat). Modellkísérletekben kimutattuk, hogy a furazolidon-rezisztencia keletkezé­sének gyako­risága nagyon alacsony (< 10-9), azaz a ND tartalmú mikrobicid készítmény várható piaci élettartama jelentôsen meghaladja az anti­biotikumokét.

Csávázószerként alkalmazva a keverék hatékonysága és hatástartóssága megfelelônek bizonyult a rizs maggal terjedô baktériumos hervadása ellen (4. táblázat).

 

4. táblázat Rizs bakteriumos hervadása elleni hatás

 

Kezelések

Dózis (g h.-a. per t)

 

No.

Vegyületekb

300a

700

1000

 

1

Furazolidon

29

43

71

 

2

Karbendazim

0

0

21

 

 

1+2  (3:7)

43

61

96

 

 

Az azonos módon készített szerformákkal csávázott rizsmagvakat nedves perlitben csí­ráz­­tattuk, és a koleoptil kitôrése elôtt megfertôztük a csírahüvelyeket távolkeleti rizsmintából izolált Xanthomonas oryzae baktériummal. A koleoptil kifejlôdését követôen értékeltük a kezelések hatását összeszámolva az egészséges növényeket, és a fertôzésmentes kezeletlen  kontrollhoz viszonyítva számítottuk ki a vegyületek csírapusztulásgátló hatását a következô képlet segítségével: Gátló hatás (%)=100´( Xi-B)/(K-B); ahol Xi= egészséges növények száma az I vegyülettel kezelt állományban, B=egészséges növények száma a kezeletlen magvakból kelt és mesterségesen fertôzött állományban, K= a kezeletlen magvakból kelt és mesterségesen nem fertôzött állományban.

 

A fitopatogén gombák ellen önmagában a furazolidon gyenge hatású, azonban a karben­da­zimmal szinergetikus keveréket alkot. Ez a hatásnövekedés tartós, és jelentkezik a nekrotróf Fusarium és a biotróf, obligát para­zita lisztharmat ellen is (5. táblázat). 

 

 

5. táblázat Búza kórokozók elleni hatékonyság vizsgálata

 

Kezelés

Fertôzöttség gátlása (%)

Csírázó-

 

 

 

Dózis

Erysiphe

Fusarium

képesség

 

No.

Vegyület

 g h.a./ha

levélen

magvakon

%

 

 1

Kontroll

---

---

---

24

 

 2

Furazolidon

400

35

10

46

 

 3

Karbendazim

350

82

15

55

 

 4

Benomil

350

98

18

71

 

 7

3+2 (7:3)

1000

98

40

74

 

 

LSD 5%

 

         11

  8

 6

 

 

 

A táblázat szerinti hatóanyagokat tartalmazó készítmények megfelelô mennyiségét 500 liter vízben elkevertük. A preventív permetezéseket a szokásos módon virágzás (a kalászok megjelenése) kezde­tekor, a provokációs Fusarium fertôzést a permetezést követô második napon végeztük. A keze­lést követô hatodik napon értékeltük a lisztharmat fertôzöttséget a zászlóleveleken.

A magvak Fusarium fertôzöttségét a betakarítást követôen, csírázóképességüket pedig 3 hónapos raktári tárolást követôen értékeltük. Az eredményeket százalékos értékben közöljük.

A kezeletlen (kontroll) növények lisztharmat, illetve Fusarium fertôzöttsége 67 ill. 95 %. volt

Különféle kórokozók ellen a karbendazim és a furazolidon eltérô arányú keverékei mutatnak optimális hatást (2. ábra), így az Eukaryota gombák ellen a maximális hatás­növekedés a karbendazim, míg a prokaryoták ellen a furazolindon túlsúlyával érhetô el.

 

2. ábra Karbendazim és furazolidon együtthatása fonalasgombák és baktériumok

            növekedésének gát­lá­sában.

A gombákra gyakorolt hatás (telepátmérô növekedésének gátlása) 10 mg/L hatóanyag koncentrációt tartalmazó burgonya/maláta táptalajon mértük. A baktériumok elleni hatást Potency Mapping eljárással számítottuk ki (Lewi, 1976) 25 faj érzékenységét figyelembe véve.

 

Hasonló, bár fajonként eltérô mértékû hatásnövekedés mutatható ki más gombák (pl. Cytospora, Fusarium Ustilago) esetében is, a baktériumok körében azonban csak az Erwinia és a Xanthomonas nemzetség fajainak érzékenysége fokozottabb a F+K keverék iránt. A fitotoxicitást az ajánlott dózisokban alkalmazva (0.2-1 kg h.a./ha) nem tapasztaltunk.

 

Összegezve az elsôdleges hatásvizsgálatok ereményeit, megállapítottuk, hogy:

A baktérium nemzetségek érzékenysége Erwinia > Xanthomonas > Agrobacterium > Pseudomonas > Corynebacterium sorrendben változik, s az elsô két esetben a nitrofurán származékok hatékonysága növényvédelmi alkalmazás szempontjából is kielégítô.

A furazolidon és a karbendazim szinergetikus módon hat a növénykórokozó baktériu­mokra és fonalas gombákra egyaránt. A szinergizmus mértéke miatt e két hatóanyag optimalizált keverékét tartalmazó készítmény hatékonysága eléri a sztreptomicin illetve benomil tartalmúakét.

Az új, furazolidon+karbendazim tartalmú készítmény használatát elsôsorban bakteriumok okozta károk megelôzésére java­soljuk; gabonafélékben (Xanthomonas), burgonyában (Erwinia) és almában (Erwina).

 

Irodalom

 

Dekker J. (1987): Development of resistance to modern fungicides and strategies for its avoidance. In: Modern selective fungicides. Ed.: H. Lyr, Gustav Fisher Verlag, Jena, pp. 13-22

Knudsen K.E.B. (2001): Development of antibiotic resistance and options to replace antimicrobials in animal diets. Proceedings of The Nutrition Society, 60 (3): 291-299.

Lewi P.J. (1976): Spectral mapping, a technique for classifying biological activity profiles of chemical compounds. Arzneimittel-Forschung. 26:1295-1300.

Lyr H. (1987): Selectivity in modern fungicides and its basis. In: Modern selective fungicides. Ed.: H. Lyr, Gustav Fisher Verlag, Jena, pp. 23-38.

Manulis S., Zutra D., Kleitman F., Dror O., David I., Zilberstaine M. and Shabi E. (1998): Distribution of streptomycin-resistant strains of Erwinia amylovora in Israel and occurrence of blossom blight in the autumn. Phytoparasitica,  26: 223-230.

Matolcsy G., Oros G., Kômíves T. and Andriska V. (1994): A family of new, non-ETU generating dithiocarbamate microbicides. In: Brighton Crop Protection Conference - Pests and Diseases, 1994. vol.2. pp. 633-540.

Nuclo R.L., Johnson K.B., Stockwell V.O. and Sugar D. (1998): Secondary colon­iz­ation of pear blossoms by two bacterial antagonists of the fire blight pathogen. Plant Disease,  82 (6): 661-668

Oros G.,  Cserhati T. and Forgacs E. (2001): Strength and selectivity of the fungicidal effect  of diazobenzene dyes. Fresenius Environmental Bulletin, 10:319-322.

Oros G., Szôgy M., Cserháti T. (1986): Effect of some new crown ethers on plant related bacteria and their possible mode of action. Acta Microbiologica Hungarica, 33:117-123.

Oros, G. and Ujváry I. (1999): Botanical fungicides: natural and semi-synthetic ceveratrum alkaloids. Pesticide Science, 55:253-264.

Oros, G., Ujváry I. and Nachman R. (1999): Antimicrobial properties of o-carboranyl alanine. Amino Acids, 17:357-368.

Palmer E.L., Teviotdale B.L., Jones A.L. (1997): A relative of the broad-host-range plasmid RSF1010 detected in Erwinia amylovora. Applied and Environmental Microbiology,  63: 4604-4607.

Sachs G. (1997): Proton Pump Inhibitors and Acid-Related Diseases. Pharmacotherapy, 17:22-37

Sholberg P.L., Bedford K.E., Haag P. and Randall P. (2001): Survey of Erwinia amylovora isolates from British Columbia for resistance to bactericides and virulence on apple. Canadian Journal of Plant Pathology, 23: 60-67.

Smalla K., Heuer H., Gotz A., Niemeyer D., Krogerrecklenfort E. and Tietze E. (2000): Exogenous isolation of antibiotic resistance plasmids from piggery manure slurries reveals a high prevalence and diversity of IncQ-like plasmids. Applied and Environmental Microbiology,  66:4854.

 

New possibilites to combat yield losses caused by plant associated bacteria

 

Detre T1, Komáromi I.1, Oros G.2, Rejtô L.1 and Szegô A.1

 

1Vet-Pharma Kft., 1225 Budapest - Nagytétény Bányalég u. 2.

2MTA Növényvédelmi Kutatóintézete, 1525 Budapest 114. Pf. 102.

 

The nitrofuran derivative furazolidone, formerly used in veterinary, significantly and selectively inhibits phytopathogenic Erwi­nia and Xanthomonas species (MIC < 25 mg/L). Antimicrobial activity of its synergetic mixtures with benzimidazole derivatives surpass benomyl and streptomycin against fungi (Cytospora, Fusarium, Helminthosporium and Ustilago) as well as bacteria (Erwinia, Xanthomo­nas). The optimized mixtures efficiently inhibit streptomycin tolerant bacteria, the probability (f) of the appearance of strains with acquired resistance is low (f < 10-9).